Standardní Amesův test
Amesův test je široce používaný test pro detekci mutagenního potenciálu v chemických sloučeninách, včetně N-Nitrosaminů. Přes svůj význam v toxikologickém screeningu má standardní Amesův test několik omezení, zejména při hodnocení sloučenin vyžadujících komplexní metabolickou aktivaci.
Omezení standardního Amesova testu
I když Amesův test zůstává základním kamenem testování mutagenity, má určitá omezení:
- Omezená metabolická aktivace:
Standardní Amesův test obvykle používá krysí játra S9, která postrádají určité enzymy cytochromu P450 (CYP) relevantní pro člověka. To může vést k nedostatečné aktivaci prokarcinogenů (např. některých N-nitrosaminů) nebo nadměrné aktivaci rizik jiných než pro člověka. Příklad: Krysí S9 ve srovnání s lidskými enzymy špatně metabolizuje N-nitrosodiethylamin (NDEA), což riskuje falešně negativní výsledky.
- Detekce omezeného spektra mutací:
Standardní kmeny (např. TA98, TA100) detekují pouze specifické typy mutací (posuny rámců, substituce párů bází), chybějící klastogeny nebo epigenetické karcinogeny.
- Nadměrná závislost na bakteriálních systémech:
Vzhledem k tomu, že test používá Salmonella typhimurium, nebere v úvahu mechanismy opravy DNA přítomné v savčích buňkách, které potenciálně postrádají některé mutagenní účinky.
- Falešná pozitiva a negativa:
Některé nemutagenní sloučeniny mohou poskytovat pozitivní výsledky v důsledku bakteriálních stresových reakcí, zatímco některé mutageny vyžadující komplexní metabolickou aktivaci mohou zůstat neodhaleny.
Vylepšený Amesův test
Poslední vydání Q&As Guidance EMA uvádí, že vzhledem k nízké citlivosti některých N-nitrosaminů (např. NDMA) za podmínek standardního Amesova testu se doporučují podmínky Enhanced Ames testu poskytnutého Národním centrem pro toxikologický výzkum (NCTR) FDA. FDA dospěl k závěru, že standardní metody používané pro Amesův test nemusí být dostatečné k charakterizaci mutagenního potenciálu N-nitrosaminů a v některých případech mohou vést k negativním výsledkům pro známé mutagenní nitrosaminy. V reakci na to Národní centrum pro toxikologický výzkum FDA testovalo různé podmínky pro vývoj Enhanced Ames Test, který má poskytnout spolehlivější posouzení mutagenního potenciálu nečistot N-nitrosaminu.
Následující podmínky Enhanced Ames Test (EAT) poskytuje FDA
|
Testovací kmeny |
Obsahuje Salmonella typhimurium TA98, TA100. TA1535, TA1537 a Escherichia coli WP2 uvrA (pKM101) testovací kmen |
|
Zkušební metoda a doba před-izolace |
Měly by být použity metody předběžné izolace a neplochého uložení s doporučenou dobou předběžné izolace 30 minut. |
|
S9 Typ a koncentrace |
Enhanced Ames test by měl být proveden s obsahem 30 % krysích jater S9 a 30 %Křeččí játra S9. Desmosomální supernatanty krys a křečků (S9s) by měly být připraveny z jater hlodavců ošetřenýchenzym cytochrom P450-indukující látky (např. kombinace fenobarbitalu a β-naftoflavonu). |
|
Negativní kontrola (rozpouštědlo/pomocná látka). |
Použitá rozpouštědla by měla být kompatibilní s Amesovým testem podleOECD 471pokyny. Mezi dostupná rozpouštědla patří, ale nejsou omezena na: (1) voda; (2) Organická rozpouštědla, jako je acetonitril, methanol a dimethylsulfoxid (DMSO). Při použití organických rozpouštědel by měl být použit nejnižší možný objem v předzádržné směsi a mělo by být prokázáno, že množství použitého organického rozpouštědla neinterferuje s metabolickou aktivací N-nitrosaminů. |
|
Pozitivní kontrola |
Podle pokynů OECD 471 by měly být pozitivní kontroly specifické pro kmeny prováděny současně. V přítomnosti S9 by měly být jako pozitivní kontroly použity také dva N-nitrosaminy, o kterých je známo, že jsou mutagenní. Dostupné N-nitrosaminové pozitivní kontroly zahrnují: NDMA, 1-cyklopentyl-4-nitrosopiperazin NDSRI. |
|
Všechna ostatní doporučení ohledně Amesova určení by se měla řídit pokyny OECD 471 |
|
Jedinečná výhoda frakce Hamster Liver S9
Frakce Křeččích jater S9 je zvláště cenná při Amesově testování díky své vynikající schopnosti aktivovat určité N-Nitrosaminy ve srovnání s potkaními játry S9. Sdílí bližší metabolický profil než lidské jaterní enzymy, takže je relevantnější pro hodnocení rizik pro člověka. Křeččí játra S9 navíc obsahují vyšší hladiny specifických enzymů cytochromu P450, které jsou klíčové pro bioaktivaci mutagenů. To má za následek zlepšenou citlivost a snížení falešně-negativních četností, což umožňuje lepší detekci mutagenů, které by jinak mohly zůstat nedetekovány samotnými potkaními játry S9.
Závěr
Zatímco standardní Amesův test zůstává základním nástrojem pro hodnocení mutagenity, jeho omezení vyžadují zlepšení pro lepší přesnost. Vylepšený Amesův test, zejména se zahrnutím frakce S9 z křeččích jater, významně zlepšuje detekci komplexních mutagenů, jako jsou N-Nitrosaminy, a překlenuje propast mezi bakteriálním a savčím metabolismem. Tento pokrok poskytuje spolehlivější metodu pro hodnocení potenciálních lidských karcinogenů a podporuje lepší regulační rozhodování-
Klíčová slova: N-Nitrosaminy, NDSRI, OECD 471, Enhanced Ames test, Křeččí játra S9, Cytochrom P450 enzymy, Mutační test
Čas příspěvku: 2025-03-12 09:22:09