Standartinis Ames testas
Ames testas yra plačiai naudojamas tyrimas siekiant nustatyti mutageninį potencialą cheminiuose junginiuose, įskaitant N-nitrozaminus. Nepaisant svarbos atliekant toksikologinį patikrinimą, standartinis Ames testas turi keletą apribojimų, ypač vertinant junginius, kuriems reikalingas sudėtingas metabolinis aktyvinimas.
Standartinio Ames testo apribojimai
Nors Ames testas išlieka kertiniu mutageniškumo bandymų akmeniu, jis turi tam tikrų apribojimų:
- Ribotas metabolinis aktyvinimas:
Standartiniame Ames teste paprastai naudojamos žiurkės kepenų S9, kuriose trūksta tam tikrų žmogui svarbių citochromo P450 (CYP) fermentų. Dėl to gali suaktyvėti prokancerogenai (pvz., kai kurie N-nitrozaminai) arba pernelyg suaktyvėti nežmonėms keliami pavojai. Pavyzdys: Žiurkė S9 silpnai metabolizuoja N-nitrozodietilaminą (NDEA), palyginti su žmogaus fermentais, todėl kyla klaidingų neigiamų rezultatų rizika.
- Riboto mutacijų spektro aptikimas:
Standartinės padermės (pvz., TA98, TA100) aptinka tik specifinius mutacijų tipus (kadrų poslinkius, bazinių porų pakaitalus), trūkstamus klastogenus arba epigenetinius kancerogenus.
- Per didelis pasikliovimas bakterinėmis sistemomis:
Kadangi bandyme naudojama Salmonella typhimurium, jame neatsižvelgiama į žinduolių ląstelėse esančius DNR atstatymo mechanizmus, todėl galbūt trūksta tam tikro mutageninio poveikio.
- Klaidingi teigiami ir neigiami dalykai:
Kai kurie ne mutageniniai junginiai gali duoti teigiamų rezultatų dėl bakterijų streso atsako, o kai kurie mutagenai, kuriems reikalinga sudėtinga metabolinė aktyvacija, gali likti neaptikti.
Patobulintas Ames testas
Naujausiose EMA klausimų ir atsakymų gairėse teigiama, kad dėl mažo kai kurių N-nitrozaminų (pvz., NDMA) jautrumo standartinio Ames testo sąlygomis rekomenduojamos FDA Nacionalinio toksikologinių tyrimų centro (NCTR) pateikto patobulinto Ames testo sąlygos. FDA padarė išvadą, kad standartinių metodų, naudojamų Ames testui, gali nepakakti N-nitrozaminų mutageniniam potencialui apibūdinti, o kai kuriais atvejais gali duoti neigiamų žinomų mutageninių nitrozaminų rezultatų. Reaguodama į tai, FDA Nacionalinis toksikologinių tyrimų centras išbandė įvairias sąlygas, kad sukurtų patobulintą Ames testą, kuris yra skirtas patikimesniam N-nitrozamino priemaišų mutageninio potencialo įvertinimui.
FDA pateikia šias patobulinto Ames testo (EAT) sąlygas
|
Išbandyti padermes |
Apima Salmonella typhimurium TA98, TA100. TA1535, TA1537 ir Escherichia coli WP2 uvrA (pKM101) bandomasis štamas |
|
Bandymo metodas ir išankstinės izoliacijos laikas |
Reikėtų naudoti išankstinės izoliacijos ir neplokštumos metodus, o rekomenduojamas išankstinės izoliacijos laikas yra 30 minučių. |
|
S9 tipas ir koncentracija |
„Enhanced Ames“ testas turėtų būti atliktas, kai yra 30% žiurkių kepenų S9 ir 30%Žiurkėno kepenys S9. Žiurkių ir žiurkėnų desmosominiai supernatantai (S9) turi būti ruošiami iš graužikų kepenų, apdorotųcitochromo P450 fermentas-indukuojančios medžiagos (pvz., fenobarbitalio ir β-naftolavono derinys). |
|
Neigiama (tirpiklis/pagalbinė medžiaga) kontrolė |
Naudojami tirpikliai turi būti suderinami su Ames testu pagalOECD 471gaires. Galimi tirpikliai apima, bet tuo neapsiribojant: (1) Vanduo; (2) Organiniai tirpikliai, tokie kaip acetonitrilas, metanolis ir dimetilsulfoksidas (DMSO). Naudojant organinius tirpiklius, reikia naudoti mažiausią įmanomą tūrį pirminio laikymo mišinyje ir įrodyti, kad naudojamas organinio tirpiklio kiekis netrukdo metabolinei N-nitrozaminų aktyvacijai. |
|
Teigiamas valdymas |
Remiantis OECD 471 gairėmis, tuo pačiu metu turi būti atliekamos specifinės padermės teigiamos kontrolės. Esant S9, du mutageniški N-nitrozaminai taip pat turėtų būti naudojami kaip teigiami kontroliniai mėginiai. Galimi teigiami N-nitrozamino kontroliniai preparatai: NDMA, 1-ciklopentilas-4-nitrosopiperazino NDSRI. |
|
Visos kitos rekomendacijos dėl Ames nustatymo turi atitikti EBPO 471 gaires |
|
Unikalus žiurkėno kepenų S9 frakcijos pranašumas
Žiurkėno kepenų S9 frakcija yra ypač vertinga atliekant Ames testą, nes ji geriau suaktyvina tam tikrus N-nitrozaminus, palyginti su žiurkės kepenimis S9. Jo metabolizmo profilis yra artimesnis žmogaus kepenų fermentams, todėl jis yra tinkamesnis vertinant riziką žmonėms. Be to, žiurkėnų kepenyse S9 yra daugiau specifinių citochromo P450 fermentų, kurie yra labai svarbūs mutagenų biologiniam aktyvavimui. Dėl to padidėja jautrumas ir sumažėja klaidingai neigiamų rezultatų dažnis, leidžiantis geriau aptikti mutagenus, kurie kitu atveju gali likti neaptikti naudojant vien žiurkių kepenų S9.
Išvada
Nors standartinis Ames testas išlieka pagrindine mutageniškumo vertinimo priemone, dėl jo apribojimų reikia tobulinti, kad būtų užtikrintas didesnis tikslumas. Patobulintas Ames testas, ypač įtraukus žiurkėnų kepenų S9 frakciją, žymiai pagerina sudėtingų mutagenų, tokių kaip N-nitrozaminai, aptikimą, sumažindamas atotrūkį tarp bakterijų ir žinduolių metabolizmo. Ši pažanga suteikia patikimesnį metodą galimiems žmonėms kancerogenams įvertinti ir padeda priimti geresnius reguliavimo sprendimus.
Raktiniai žodžiai: N-nitrozaminai, NDSRI, OECD 471, sustiprintas Ames testas, žiurkėno kepenys S9, citochromo P450 fermentai, mutacijų testas
Įrašo laikas: 2025-03-12 09:22:09