Standard Ames-test
Ames-testet är en allmänt använd analys för att detektera mutagen potential i kemiska föreningar, inklusive N-Nitrosaminer. Trots sin betydelse vid toxikologisk screening har Ames-standardtestet flera begränsningar, särskilt när man utvärderar föreningar som kräver komplex metabolisk aktivering.
Begränsningar för Standard Ames Test
Även om Ames-testet förblir en hörnsten i mutagenitetstestning, har det vissa begränsningar:
- Begränsad metabolisk aktivering:
Standard Ames Test använder vanligtvis råttlever S9, som saknar vissa humanrelevanta cytokrom P450 (CYP) enzymer. Detta kan leda till underaktivering av procarcinogener (t.ex. vissa N-nitrosaminer) eller överaktivering av icke-mänskliga faror. Exempel: Råtta S9 metaboliserar dåligt N-nitrosodietylamin (NDEA) jämfört med mänskliga enzymer, vilket riskerar falska negativa effekter.
- Begränsad mutationsspektrumdetektion:
Standardstammar (t.ex. TA98, TA100) upptäcker endast specifika mutationstyper (ramskiften, bas-parsubstitutioner), saknade klastogener eller epigenetiska cancerframkallande ämnen.
- Över-beroende på bakteriesystem:
Eftersom testet använder Salmonella typhimurium, tar det inte hänsyn till DNA-reparationsmekanismer som finns i däggdjursceller, vilket potentiellt saknar vissa mutagena effekter.
- Falskt positivt och negativt:
Vissa icke-mutagena föreningar kan ge positiva resultat på grund av bakteriell stressreaktion, medan vissa mutagener som kräver komplex metabolisk aktivering kan förbli oupptäckta.
Det förbättrade Ames-testet
EMA:s senaste utgåva Q&S Guidance säger att på grund av den låga känsligheten hos vissa N-nitrosaminer (t.ex. NDMA) under villkoren för standard Ames-test, rekommenderas villkoren för Enhanced Ames Test från FDA:s National Center for Toxicological Research (NCTR). FDA har kommit fram till att standardmetoderna som används för Ames-testet kanske inte är tillräckliga för att karakterisera den mutagena potentialen hos N-nitrosaminer, och i vissa fall kan de ge negativa resultat för kända mutagena nitrosaminer. Som svar har FDA:s nationella centrum för toxikologisk forskning testat olika förhållanden för att utveckla Enhanced Ames Test, som är avsett att ge en mer tillförlitlig bedömning av den mutagena potentialen hos N-nitrosaminföroreningar.
Följande villkor för Enhanced Ames Test (EAT) tillhandahålls av FDA
|
Testa stammar |
Inkluderar Salmonella typhimurium TA98, TA100. TA1535, TA1537 och Escherichia coli WP2 uvrA (pKM101) teststam |
|
Testmetod och förisoleringstid |
Förisolering och icke-flatbäddsmetoder bör användas, med en rekommenderad förisoleringstid på 30 minuter. |
|
S9 Typ och koncentration |
Enhanced Ames-testet bör utföras med 30 % råttlever S9 och 30 %Hamsterlever S9. Desmosomala supernatanter från råtta och hamster (S9s) bör framställas från gnagarlever behandlade medcytokrom P450 enzym-inducerande ämnen (t.ex. en kombination av fenobarbital och β-naftoflavon). |
|
Negativ (lösningsmedel/hjälpämne) kontroll |
Lösningsmedlen som används ska vara kompatibla med Ames-testet enligtOECD 471riktlinjer. Tillgängliga lösningsmedel inkluderar, men är inte begränsade till: (1) Vatten; (2) Organiska lösningsmedel såsom acetonitril, metanol och dimetylsulfoxid (DMSO). När organiska lösningsmedel används ska lägsta möjliga volym i den förhållande blandningen användas och det bör påvisas att mängden organiskt lösningsmedel som används inte stör den metaboliska aktiveringen av N-nitrosaminer. |
|
Positiv kontroll |
Enligt OECD 471 riktlinjer ska stamspecifika positiva kontroller utföras samtidigt. I närvaro av S9 bör de två N-nitrosaminer som är kända för att vara mutagena också användas som positiva kontroller. Tillgängliga N-nitrosamin positiva kontroller inkluderar: NDMA, 1-cyklopentyl-4-nitrosopiperazin NDSRI. |
|
Alla andra rekommendationer om Ames-bestämning bör följa OECD 471:s riktlinjer |
|
Unik fördel med hamsterlever S9 fraktion
Hamsterlever S9-fraktion är särskilt värdefull i Ames-testning på grund av dess överlägsna förmåga att aktivera vissa N-Nitrosaminer jämfört med råttlever S9. Den delar en närmare metabolisk profil till mänskliga leverenzymer, vilket gör den mer relevant för mänsklig riskbedömning. Dessutom innehåller hamsterlever S9 högre nivåer av specifika cytokrom P450-enzymer, som är avgörande för bioaktiveringen av mutagener. Detta resulterar i förbättrad känslighet och minskade falsk-negativa frekvenser, vilket möjliggör bättre upptäckt av mutagener som annars kan gå oupptäckt med enbart råttlever S9.
Slutsats
Medan standard Ames-testet förblir ett grundläggande verktyg för att bedöma mutagenicitet, kräver dess begränsningar förbättringar för bättre noggrannhet. Det förbättrade Ames-testet, särskilt med inkluderandet av hamsterlever S9-fraktion, förbättrar avsevärt upptäckten av komplexa mutagener som N-Nitrosaminer, vilket överbryggar gapet mellan bakteriell och däggdjursmetabolism. Detta framsteg ger en mer tillförlitlig metod för att utvärdera potentiella humana cancerframkallande ämnen och stödjer bättre regulatoriskt beslutsfattande.
Nyckelord: N-Nitrosaminer, NDSRI, OECD 471, Enhanced Ames test, Hamster lever S9, Cytokrom P450 enzymer, Mutationstest
Inläggstid: 2025-03-12 09:22:09