Prueba estándar de Ames
La prueba AMES es un ensayo ampliamente utilizado para detectar potencial mutagénico en compuestos químicos, incluidas las n - nitrosaminas. A pesar de su importancia en la detección toxicológica, la prueba estándar de AMES tiene varias limitaciones, particularmente al evaluar los compuestos que requieren activación metabólica compleja.
Limitaciones de la prueba estándar de Ames
Si bien la prueba de Ames sigue siendo una piedra angular en las pruebas de mutagenicidad, tiene ciertas limitaciones:
- Activación metabólica limitada:
La prueba estándar de AMES generalmente usa el hígado de rata S9, que carece de ciertas enzimas del citocromo P450 (CYP) humanos. Esto puede conducir a la subactivación de los procinógenos (por ejemplo, algunas n - nitrosaminas) o una sobreactivación de riesgos no humanos. Ejemplo: la rata S9 metaboliza mal n - nitrosodietilamina (NDEA) en comparación con las enzimas humanas, arriesgando falsos negativos.
- Detección de espectro de mutación limitada:
Las cepas estándar (p. Ej., TA98, TA100) detectan solo tipos de mutación específicos (desplazamientos de marco, sustituciones de base - pares), clastógenos faltantes o carcinógenos epigenéticos.
- Sobre - dependencia de los sistemas bacterianos:
Dado que la prueba usa Salmonella typhimurium, no tiene en cuenta los mecanismos de reparación de ADN presentes en las células de mamíferos, lo que puede perder algunos efectos mutagénicos.
- Falsos positivos y negativos:
Algunos compuestos no mutagénicos pueden producir resultados positivos debido a las respuestas del estrés bacteriano, mientras que algunos mutágenos que requieren activación metabólica compleja pueden quedarse sin detectar.
La prueba de Ames mejorada
La última guía de preguntas y respuestas de lanzamiento de EMA establece que, debido a la baja sensibilidad de algunas n - nitrosaminas (por ejemplo, NDMA) en las condiciones de la prueba estándar de AMES, se recomiendan las condiciones de la prueba de AMES mejorada proporcionada por el Centro Nacional de Investigación Toxicológica (NCTR) de la FDA. La FDA ha concluido que los métodos estándar utilizados para la prueba de Ames pueden no ser suficientes para caracterizar el potencial mutagénico de las nitrosaminas N - En respuesta, el Centro Nacional de Investigación Toxicológica de la FDA ha estado probando diferentes condiciones para desarrollar la prueba de AMES mejorada, que tiene la intención de proporcionar una evaluación más confiable del potencial mutagénico de las impurezas de nitrosamina N -
La FDA proporciona las siguientes condiciones de prueba de Ames (EAT)
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Cepas de prueba |
Incluye Salmonella typhimurium TA98, TA100. TA1535, TA1537 y Escherichia coli Tensión de prueba WP2 UVRA (PKM101) |
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Método de prueba y tiempo de aislamiento previo |
Los métodos de pre - aislamiento y no - de lecho plano deben usarse, con un tiempo de aislamiento recomendado de 30 minutos. |
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Tipo s9 y concentración |
La prueba de AMES mejorada debe realizarse para contener al 30% de hígado de rata S9 y 30%Hígado de hámster s9. Los sobrenadantes desmosomales de rata y hámster (S9S) deben prepararse a partir de hígados de roedores tratados conenzima citocromo P450- Sustancias inductoras (por ejemplo, una combinación de fenobarbital y β - nafthoflavona). |
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Control negativo (solvente/excipiente) |
Los solventes utilizados deben ser compatibles con la prueba de ames de acuerdo conOCDE 471pautas. Los solventes disponibles incluyen, pero no se limitan a: (1) agua; (2) Solventes orgánicos como acetonitrilo, metanol y dimetil sulfóxido (DMSO). Cuando se usan solventes orgánicos, se debe usar el volumen más bajo posible en la mezcla previa a la retención y debe demostrarse que la cantidad de solvente orgánico utilizado no interfiere con la activación metabólica de n - nitrosaminas. |
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Control positivo |
Según las pautas de la OCDE 471, los controles positivos específicos se deben realizar al mismo tiempo. En presencia de S9, las dos nitrosaminas n - que se sabe que son mutagénicas también deben usarse como controles positivos. Disponible N - Los controles positivos de nitrosamina incluyen: NDMA, 1 - ciclopentil - 4 - nitrosopiperazine ndsris。 |
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Todas las demás recomendaciones sobre la determinación de Ames deben seguir las pautas de la OCDE 471 |
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Ventaja única de la fracción de hígado de hámster s9
La fracción de hígado Hamster S9 es particularmente valiosa en las pruebas de Ames debido a su capacidad superior para activar ciertas n - nitrosaminas en comparación con el hígado de rata S9. Comparte un perfil metabólico más cercano a las enzimas hepáticas humanas, lo que lo hace más relevante para la evaluación de riesgos humanos. Además, el hígado de hámster S9 contiene niveles más altos de enzimas citocromo específicas P450, que son cruciales para la bioactivación de mutágenos. Esto da como resultado una sensibilidad mejorada y una reducción de tasas falsas - negativas, lo que permite una mejor detección de mutágenos que de otro modo podrían no ser detectados con el hígado de rata S9 solo.
Conclusión
Si bien la prueba estándar de AMES sigue siendo una herramienta fundamental para evaluar la mutagenicidad, sus limitaciones requieren mejoras para una mejor precisión. La prueba de AMES mejorada, particularmente con la inclusión de la fracción del hígado del hámster S9, mejora significativamente la detección de mutágenos complejos como las nitrosaminas N - Este avance proporciona un método más confiable para evaluar los posibles carcinógenos humanos y apoya una mejor decisión regulatoria.
Palabras clave: n - nitrosaminas, ndsris, OCDE 471, prueba de Ames mejorada, hígado de hámster S9, enzimas citocromo P450, prueba de mutación
Tiempo de publicación: 2025 - 03 - 12 09:22:09