Standarta Ames tests
AMES tests ir plaši izmantots tests, lai noteiktu mutagēno potenciālu ķīmiskos savienojumos, ieskaitot n - nitrozamīnus. Neskatoties uz to nozīmi toksikoloģiskajā skrīningā, standarta AMES testam ir vairāki ierobežojumi, it īpaši, novērtējot savienojumus, kuriem nepieciešama sarežģīta metaboliskā aktivācija.
Standarta Ames testa ierobežojumi
Kamēr Ames tests joprojām ir mutagenitātes pārbaudes stūrakmens, tam ir daži ierobežojumi:
- Ierobežota metabolisma aktivizēšana:
Standarta AMES testā parasti tiek izmantoti žurku aknu S9, kurai trūkst noteiktu cilvēku - attiecīgo citohroma P450 (CYP) enzīmu. Tas var izraisīt prokarcinogēnu (piemēram, dažus n - nitrozamīnu) nepietiekamību vai cilvēku briesmu pārmērīgu aktivizēšanu. Piemērs: žurku S9 vāji metabolizē n - nitrosodietilamīnu (NDEA), salīdzinot ar cilvēka fermentiem, riskējot ar viltus negatīviem.
- Ierobežota mutāciju spektra noteikšana:
Standarta celmi (piemēram, TA98, TA100) noteikt tikai specifiskus mutāciju veidus (kadru maiņu, pamatni - pāra aizvietojumi), trūkstošos klastogēnus vai epiģenētiskos kancerogēnus.
- Vairāk - paļaušanās uz baktēriju sistēmām:
Tā kā testā tiek izmantots Salmonella typhimurium, tas neņem vērā DNS atjaunošanas mehānismus, kas atrodas zīdītāju šūnās, potenciāli trūkst dažu mutagēnu efektu.
- Viltus pozitīvi un negatīvi:
Daži ne - mutagēni savienojumi var dot pozitīvus rezultātus baktēriju stresa reakciju dēļ, savukārt daži mutagēni, kuriem nepieciešama sarežģīta metaboliskā aktivācija, var tikt pamanīti.
Pastiprinātais Ames tests
EMA jaunākajā izlaiduma jautājumos un kā vadlīnijās teikts, ka dažu n - nitrozamīnu (piemēram, NDMA) zemā jutīguma dēļ standarta AMES testa apstākļos ir ieteicams uzlabot AMES testu, ko nodrošina FDA Nacionālais toksikoloģisko pētījumu centrs (NCTR). FDA ir secinājusi, ka AMES testā izmantotās standarta metodes var nebūt pietiekamas, lai raksturotu n - nitrozamīnu mutagēno potenciālu, un dažos gadījumos tas var radīt negatīvus rezultātus zināmiem mutagēniem nitrozamīniem. Atbildot uz to, FDA Nacionālais toksikoloģisko pētījumu centrs ir pārbaudījis dažādus apstākļus, lai izstrādātu pastiprinātu AMES testu, kas ir paredzēts, lai sniegtu ticamāku N - nitrozamīna piemaisījumu mutagēniskā potenciāla novērtējumu.
FDA nodrošina šādus pastiprinātus Ames testa (EAT) apstākļus
|
Testa celmi |
Ietver Salmonella Typhimurium TA98, TA100. TA1535, TA1537 un Escherichia coli WP2 UVRA (PKM101) testa celms |
|
Pārbaudes metode un pirms - izolācijas laiks |
Jāizmanto iepriekšēja - izolācija un bezbalstības metodes ar ieteicamo pirms - izolācijas laiku 30 minūtes. |
|
S9 tips un koncentrācija |
Paaugstinātais AMES tests jāveic, saturot 30% žurku aknu S9 un 30%Kāmja aknas S9Apvidū Žurku un kāmja desmosomālie supernatanti (S9) jāsagatavo no grauzēju aknām, kas apstrādātas arcitohroma P450 enzīms- inducējošas vielas (piemēram, fenobarbitāla un β - naftoflavona kombinācija). |
|
Negatīva (šķīdinātāja/palīgviela) kontrole |
Izmantotajiem šķīdinātājiem jābūt savietojamiem ar Ames testu atbilstošiESAO 471Vadlīnijas. Pieejamie šķīdinātāji ir, bet ne tikai: (1) ūdens; (2) Organiski šķīdinātāji, piemēram, acetonitrils, metanols un dimetilsulfoksīds (DMSO). Ja tiek izmantoti organiskie šķīdinātāji, jāizmanto zemākais iespējamais tilpums pirms - turēšanas maisījumā, un jāpierāda, ka izmantotā organiskā šķīdinātāja daudzums netraucē N - nitrozamīnu metaboliski aktivizēšanu. |
|
Pozitīva kontrole |
Saskaņā ar ESAO 471 vadlīnijām celms - vienlaikus jāveic īpašas pozitīvas kontroles. S9 klātbūtnē divi n - nitrosamīni, par kuriem zināms, ka tie ir mutagēni, jāizmanto arī kā pozitīvas kontroles. Pieejams n - nitrosamīna pozitīvās kontroles ietver: NDMA, 1 - Cyclopentyl - 4 - Nitrosopiperazine ndsris。 |
|
Visiem pārējiem ieteikumiem par AMES noteikšanu jāievēro ESAD 471 vadlīnijas |
|
Kāmja aknu S9 frakcijas unikālā priekšrocība
Kāmja aknu S9 frakcija ir īpaši vērtīga AMES testēšanā, pateicoties tā augstākajai spējai aktivizēt noteiktus n - nitrozamīnus, salīdzinot ar žurku aknu S9. Tam ir ciešāks metabolisma profils cilvēku aknu enzīmiem, padarot to atbilstošāku cilvēka riska novērtēšanai. Turklāt kāmja aknās S9 satur augstāku specifisko citohroma P450 enzīmu līmeni, kas ir izšķirošs mutagēnu bioaktivācijai. Tā rezultātā uzlabojas jutība un samazināta viltus - negatīvā likme, ļaujot labāk noteikt mutagēnus, kas citādi var nepamanīt tikai ar žurku aknām S9.
Secinājums
Kaut arī standarta AMES tests joprojām ir būtisks līdzeklis mutagenicitātes novērtēšanai, tā ierobežojumiem ir jāuzlabo labāka precizitāte. Paaugstinātais AMES tests, īpaši ar kāmja aknu S9 frakcijas iekļaušanu, ievērojami pastiprina tādu sarežģītu mutagēnu kā n - nitrozamīnu noteikšanu, pārvarot plaisu starp baktēriju un zīdītāju metabolismu. Šis progress nodrošina ticamāku metodi potenciālo cilvēku kancerogēnu novērtēšanai un atbalsta labāku normatīvo lēmumu - pieņemot.
Atslēgas vārdi: n - nitrozamīni, ndsris, OECD 471, pastiprināts AMES tests, kāmja aknas S9, citohroma P450 enzīmi, mutācijas pārbaude
Pasta laiks: 2025 - 03 - 12 09:22:09