Standardowy test Ames
Test AMES jest powszechnie stosowanym testem do wykrywania potencjału mutagennego w związkach chemicznych, w tym N - nitrozamin. Pomimo jego znaczenia w badaniu toksykologicznym, standardowy test AMES ma kilka ograniczeń, szczególnie przy ocenie związków wymagających złożonej aktywacji metabolicznej.
Ograniczenia standardowego testu Ames
Podczas gdy test Ames pozostaje kamieniem węgielnym w testowaniu mutagenności, ma on pewne ograniczenia:
- Ograniczona aktywacja metaboliczna:
Standardowy test AMES zwykle wykorzystuje wątrobę szczura S9, w której brakuje niektórych enzymów cytochromu P450 (CYP). Może to prowadzić do niedaktywacji prokarcinogenów (np. Niektóre n - nitrozaminy) lub nadmiernie aktywacji zagrożeń innych niż ludzkie. Przykład: Rat S9 słabo metabolizuje N - nitrosodietyloaminę (NDEA) w porównaniu z enzymami ludzkimi, ryzykując fałszywe negatywy.
- Ograniczone wykrywanie widma mutacji:
Standardowe szczepy (np. TA98, TA100) wykrywają tylko specyficzne typy mutacji (SESHIFTS, Podstawienia pary zasady), brakujące klastogeny lub rakotwórcze epigenetyczne.
- Over - zależność od systemów bakteryjnych:
Ponieważ test wykorzystuje Salmonella Typhimurium, nie uwzględnia on mechanizmów naprawy DNA obecnych w komórkach ssaków, potencjalnie brakuje pewnych efektów mutagennych.
- Fałszywe pozytywy i negatywy:
Niektóre związki nie - mutagenne mogą przynieść pozytywne wyniki z powodu odpowiedzi na stres bakteryjne, podczas gdy niektóre mutagenki wymagające złożonej aktywacji metabolicznej mogą pozostać niewykryte.
Ulepszony test Ames
W najnowszym wydaniu EMA wytyczne dotyczące pytań i jako wskazujące, że ze względu na niską wrażliwość niektórych n - nitrozamin (np. NDMA) w warunkach standardowego testu AMES, warunki ulepszonego testu AMES dostarczonego przez Narodowe Centrum Badań Toksyologicznych FDA (NCTR). FDA doszło do wniosku, że standardowe metody zastosowane do testu AMES mogą nie być wystarczające do scharakteryzowania potencjału mutagenowego N - Nitrozamin, aw niektórych przypadkach mogą dawać negatywne wyniki dla znanych nitrozamin mutagenowych. W odpowiedzi Narodowe Centrum Badań Toksykologicznych FDA testowało różne warunki w celu opracowania ulepszonego testu AMES, który ma zapewnić bardziej wiarygodną ocenę potencjału mutagenowego zanieczyszczeń N - Nitrozaminy.
FDA zapewnia następujące warunki ulepszonego testu AMES (EAT)
|
Szczepy testowe |
Obejmuje Salmonella Typhimurium TA98, TA100. TA1535, TA1537 i Escherichia coli Szczep testowy WP2 UVRA (PKM101) |
|
Metoda testowa i czas izolacji |
Należy zastosować metody izolacji i niepłodne metody, z zalecanym czasem izolacji wynoszącym 30 minut. |
|
Typ S9 i stężenie |
Ulepszony test AMES należy przeprowadzić w zawierającym 30% S9 wątroby szczura i 30%Chomika Wątroba S9. Supernatanty desmosomalne szczura i chomika (S9S) należy przygotować z wątroby gryzoni traktowanychEnzym cytochromu P450- substancje indukujące (np. Połączenie fenobarbitalu i β - naftoflawonu). |
|
Kontrola ujemna (rozpuszczalnik/substancja substancji substancji substancji zarobkowej) |
Zastosowane rozpuszczalniki powinny być kompatybilne z testem AMES wedługOECD 471wytyczne. Dostępne rozpuszczalniki obejmują, ale nie ograniczają się do: (1) woda; (2) Rozpuszczalniki organiczne, takie jak acetonitryl, metanol i dimetylosulfotlenk (DMSO). Gdy stosowane są rozpuszczalniki organiczne, należy zastosować najniższą możliwą objętość w mieszaninie trzymającej i należy wykazać, że ilość zastosowanego rozpuszczalnika organicznego nie zakłóca metabolicznej aktywacji N - nitrozoamin. |
|
Kontrola pozytywna |
Zgodnie z wytycznymi OECD 471, należy jednocześnie wykonywać specyficzne kontrole pozytywne. W obecności S9 dwa n - nitrozaminy, o których wiadomo, że są mutagenne, powinny być również stosowane jako kontrole pozytywne. Dostępne N - Nitrozoamina Pozytywne kontrole obejmują: NDMA, 1 - Cyklopentyl - 4 - Ndsopiperazyna ndsris。 |
|
Wszystkie inne zalecenia dotyczące ustalenia AMES powinny być zgodne z wytycznymi OECD 471 |
|
Unikalna zaleta frakcji chomika wątroby S9
Frakcja S9 w wątrobie chomika jest szczególnie cenna w testowaniu AME ze względu na jej doskonałą zdolność do aktywowania niektórych N - nitrozamin w porównaniu z wątrobą S9 w szczurze. Dzieli bliższy profil metaboliczny ludzkim enzymom wątroby, co czyni go bardziej istotnym dla oceny ryzyka człowieka. Dodatkowo, chomika wątroby S9 zawiera wyższe poziomy specyficznych enzymów cytochromu P450, które są kluczowe dla bioaktywacji mutagenów. Powoduje to lepszą czułość i zmniejszone wskaźniki fałszywych - ujemnych, umożliwiając lepsze wykrywanie mutagenów, które w przeciwnym razie mogłyby być niewykryte z samą wątrobą szczura S9.
Wniosek
Podczas gdy standardowy test AMES pozostaje podstawowym narzędziem oceny mutagenności, jego ograniczenia wymagają poprawy lepszej dokładności. Zwiększony test AMES, szczególnie przy włączeniu frakcji S9 w wątrobie chomika, znacznie zwiększa wykrywanie złożonych mutagenów, takich jak N - nitrozaminy, wypełniając lukę między metabolizmem bakteryjnym i ssaków. Postęp ten stanowi bardziej niezawodną metodę oceny potencjalnych rakotwórczych ludzi i wspiera lepszą decyzję regulacyjną -
Słowa kluczowe: N - Nidozaminy, NDSRIS, OECD 471, Enhanced AME Test, Chomika Wątroba S9, enzymy cytochromu P450, test mutacji
Czas postu: 2025 - 03 - 12 09:22:09