Štandardný test AMES
Test AMES je široko využívaný test na detekciu mutagénneho potenciálu v chemických zlúčeninách vrátane n - nitrozamínov. Napriek jeho významnosti pri toxikologickom skríningu má štandardný test AMES niekoľko obmedzení, najmä pri hodnotení zlúčenín vyžadujúcich komplexnú metabolickú aktiváciu.
Obmedzenia štandardného testu AMES
Zatiaľ čo test AMES zostáva základným kameňom pri testovaní mutagenity, má určité obmedzenia:
- Obmedzená metabolická aktivácia:
Štandardný test AMES zvyčajne používa pečeň potkanov S9, ktorá nemá určité enzýmy ľudského - relevantného cytochrómu P450 (CYP). To môže viesť k nedostatočnej aktivácii prokarcinogénov (napr. Niektoré n - nitrozamíny) alebo nadmerne aktivácie ne - ľudských nebezpečenstiev. Príklad: potkan S9 slabo metabolizuje n - nitrosodietylamín (NDEA) v porovnaní s ľudskými enzýmami, riskuje falošné negatívy.
- Detekcia obmedzeného spektra mutácie:
Štandardné kmene (napr. TA98, TA100) detekujú iba špecifické typy mutácií (framefety, báza - párové substitúcie), chýbajúce klastí alebo epigenetické karcinogény.
- Over - spoliehanie sa na bakteriálne systémy:
Pretože test používa Salmonella Typhimurium, nezohľadňuje mechanizmy opravy DNA prítomné v bunkách cicavcov, čo potenciálne chýba niektoré mutagénne účinky.
- Falošné pozitíva a negatívy:
Niektoré ne - mutagénne zlúčeniny môžu priniesť pozitívne výsledky v dôsledku reakcií bakteriálneho stresu, zatiaľ čo niektoré mutagény vyžadujúce komplexnú metabolickú aktiváciu sa môžu nezistiť.
Vylepšený test AMES
Najnovšie vydanie otázok EMA v oblasti otázok a usmernení uvádza, že v dôsledku nízkej citlivosti niektorých n - nitrozamínov (napr. NDMA) za podmienok štandardného testu AMES sa odporúča podmienky vylepšeného testu AMES poskytnutých Národným centrom FDA pre toxikologický výskum (NCTR). FDA dospela k záveru, že štandardné metódy použité na test AMES nemusia byť dostatočné na charakterizáciu mutagénneho potenciálu n - nitrozamínov av niektorých prípadoch môžu viesť k negatívnym výsledkom známych mutagénnych nitrozamínov. V reakcii na to Národné centrum toxikologického výskumu FDA testovalo rôzne podmienky na vývoj zosilneného testu AMES, ktorý je určený na poskytnutie spoľahlivejšieho hodnotenia mutagénneho potenciálu n - nitrozamínových nečistôt.
FDA poskytuje nasledujúce podmienky vylepšeného testu AMES (EAT)
|
Skúšobné kmene |
Zahŕňa Salmonella Typhimurium TA98, TA100. TA1535, TA1537 a Escherichia coli Testovací napätie WP2 UVRA (PKM101) |
|
Testovacia metóda a čas izolácie |
Mali by sa používať metódy pre izolácie a ne - Metódy plošiny, s odporúčanou dobou izolácie v predbežnej izbe 30 minút. |
|
Typ S9 a koncentrácia |
Zvýšený test AMES by sa mal vykonať v obsahujúcom 30% pečeňovej pečene S9 a 30%Škrečok pečeň S9. Desmozomálne supernatanty potkanov a škrečka (S9S) by sa mali pripraviť z pečene hlodavcov ošetrených pomocouenzým cytochróm P450- indukujúce látky (napr. Kombinácia fenobarbitálneho a β - naftoflavónu). |
|
Negatívne riadenie (rozpúšťadlo/pomocné) |
Použité rozpúšťadlá by mali byť kompatibilné s testom AMES podľaOECD 471Pokyny. Dostupné rozpúšťadlá zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na: (1) voda; (2) Organické rozpúšťadlá, ako je acetonitril, metanol a dimetylsulfoxid (DMSO). Ak sa použijú organické rozpúšťadlá, mal by sa použiť najnižší možný objem v predbežnej zmesi a malo by sa preukázať, že množstvo použitého organického rozpúšťadla neinterfuje s metabolickou aktiváciou N - nitrozamínov. |
|
Pozitívna kontrola |
Podľa pokynov OECD 471 by sa mali súčasne vykonávať kmeňové kmeňové pozitívne kontroly. V prítomnosti S9 by sa dva n - nitrozamíny, o ktorých je známe, že sú mutagénne, používajú aj ako pozitívne kontroly. K dispozícii N - Nitrosamín pozitívne kontroly zahŕňajú: NDMA, 1 - cyklopentyl - 4 - nitrosopiperazín ndsris。 |
|
Všetky ostatné odporúčania týkajúce sa určenia AMES by sa mali riadiť pokynmi OECD 471 |
|
Jedinečná výhoda frakcie škrečka pečeň S9
Frakcia škrečka S9 S9 je obzvlášť cenná pri testovaní AMES kvôli svojej vynikajúcej schopnosti aktivovať určité N - nitrozamíny v porovnaní s pečeňou potkanov S9. Zdieľa užší metabolický profil ľudských enzýmov pečene, čo je relevantnejšie pre hodnotenie ľudského rizika. Pečeň škrečka S9 navyše obsahuje vyššie hladiny špecifických enzýmov cytochrómu P450, ktoré sú rozhodujúce pre biologickú aktiváciu mutagénov. To má za následok zlepšenú citlivosť a znížené falošné - negatívne rýchlosti, čo umožňuje lepšiu detekciu mutagénov, ktoré by inak mohli zostať nezistené samotnou pečeňou potkanov.
Záver
Zatiaľ čo štandardný test AMES zostáva základným nástrojom na hodnotenie mutagénnosti, jej obmedzenia si vyžadujú zlepšenie lepšej presnosti. Zvýšený test AMES, najmä so zahrnutím frakcie škrečkovej pečene S9, významne zvyšuje detekciu komplexných mutagénov, ako sú N - nitrozamíny, ktoré preklenujú medzeru medzi bakteriálnym a metabolizmom cicavcov. Tento pokrok poskytuje spoľahlivejšiu metódu na hodnotenie potenciálnych ľudských karcinogénov a podporuje lepšie regulačné rozhodnutie.
Kľúčové slová: N - nitrosamíny, NDSRIS, OECD 471, Enhanced AMES Test, Enzýmy Cytochrómu p450, test mutačného testu
Čas príspevku: 2025 - 03 - 12 09:22:09