Vakio Ames -testi
Ames -testi on laajalti käytetty määritys mutageenisen potentiaalin havaitsemiseksi kemiallisissa yhdisteissä, mukaan lukien n - nitrosamiinit. Huolimatta merkityksestään toksikologisessa seulonnassa, tavanomaisella AMES -testillä on useita rajoituksia, etenkin kun arvioidaan yhdisteitä, jotka vaativat monimutkaista metabolista aktivaatiota.
Standardin AMES -testin rajoitukset
Vaikka Ames -testi on edelleen kulmakivi mutageenisuuden testauksessa, sillä on tiettyjä rajoituksia:
- Rajoitettu metabolinen aktivointi:
Vakio AMES -testi käyttää tyypillisesti rotan maksa S9: tä, josta puuttuu tietyt ihmisen - Asiaankuuluvat sytokromi P450 (CYP) -entsyymit. Tämä voi johtaa prokarsinogeenien (esim. Jotkut n - nitrosamiinien) aliraja -aktivointiin tai ei -- ihmisen vaarojen yliaktivointiin. Esimerkki: Rotta S9 metaboloi huonosti n -nitrosodietyyliamiini (NDEA) verrattuna ihmisen entsyymeihin, mikä vaarantaa vääriä negatiivisia.
- Rajoitettu mutaatiospektrin havaitseminen:
Vakiokannat (esim. TA98, TA100) havaitsevat vain spesifiset mutaatiotyypit (kehyksensiirtot, emäs - parisubstituutiot), puuttuvat klastogeenit tai epigeneettiset karsinogeenit.
- Yli - luottamus bakteerijärjestelmiin:
Koska testissä käytetään salmonella typhimuriumia, siinä ei oteta huomioon nisäkkäiden soluissa olevia DNA -korjausmekanismeja, mikä puuttuu mahdollisesti joitain mutageenisia vaikutuksia.
- Väärät positiiviset ja negatiivit:
Jotkut ei -- mutageeniset yhdisteet voivat tuottaa positiivisia tuloksia bakteerien stressivasteiden vuoksi, kun taas jotkut monimutkaisen metabolisen aktivaation vaativat mutageenit voivat olla huomaamatta.
Parannettu AMES -testi
EMA: n viimeisimmässä julkaisun Q & AS AS -ohjautumisessa todetaan, että joidenkin N - nitrosamiinien (esim. NDMA) alhaisen herkkyyden vuoksi FDA: n kansallisen toksikologisen tutkimuksen keskuksen (NCTR) tehostetun AMES -testin olosuhteet. FDA on päätellyt, että AMES -testiin käytetyt standardimenetelmät eivät välttämättä riitä karakterisoimaan N - nitrosamiinien mutageenisen potentiaalin, ja joissain tapauksissa voi tuottaa negatiivisia tuloksia tunnetuille mutageenisille nitrosamiineille. Vastauksena FDA: n toksikologisen tutkimuksen keskus on testannut erilaisia olosuhteita parannetun AMES -testin kehittämiseksi, jonka tarkoituksena on tarjota luotettavampi arvio N - nitrosamiinin epäpuhtauksien mutageenisesta potentiaalista.
FDA tarjoaa seuraavat parannettu AMES -testi (EAT) -olosuhteet
|
Testikannat |
Sisältää Salmonella Typhimurium TA98, TA100. TA1535, TA1537 ja Escherichia coli WP2 UVRA (PKM101) Testikanta |
|
Testimenetelmä ja pre - eristysaika |
Pre - Eristys- ja ei -- litteämenetelmiä tulisi käyttää suositellun pre - -eristysajan ollessa 30 minuuttia. |
|
S9 -tyyppi ja pitoisuus |
Parannettu AMES -testi tulisi suorittaa 30% rotan maksan S9 ja 30%Hamsteri maksa S9. Rotta ja hamsterin desmosomaaliset supernatantit (S9S) tulisi valmistaa jyrsijöiden maksallesytokromi P450 -entsyymi- indusoivat aineet (esim. Fenobarbitaalin ja β - -bakteerin yhdistelmä). |
|
Negatiivinen (liuotin/apuaine) ohjaus |
Käytettyjen liuottimien tulisi olla yhteensopivia AMES -testin kanssaOECD 471Ohjeet. Käytettävissä olevat liuottimet sisältävät, mutta eivät rajoitu: (1) vesi; (2) orgaaniset liuottimet, kuten asetonitriili, metanoli ja dimetyylisulfoksidi (DMSO). Kun käytetään orgaanisia liuottimia, on käytettävä alhaisin mahdollinen tilavuus pre - -seoksessa ja on osoitettava, että käytetyn orgaanisen liuottimen määrä ei häiritse N - nitrosamiinien metabolista aktivaatiota. |
|
Positiivinen hallinta |
OECD 471 -ohjeiden mukaan kanta - spesifiset positiiviset kontrollit tulisi suorittaa samanaikaisesti. S9: n läsnä ollessa kahta N - nitrosamiinia, joiden tiedetään olevan mutageenisia, tulisi käyttää myös positiivisina kontrolleina. Saatavilla N -nitrosamiinin positiivisia kontrolleja ovat: NDMA, 1 - syklopentyyli - 4 - Nitrosopiperatsiini ndsris。 |
|
Kaikkien muiden AMES -määrityksen suositusten tulisi noudattaa OECD 471 -ohjeita |
|
Hamsterin maksan S9 -fraktion ainutlaatuinen etu
Hamsterin maksan S9 -fraktio on erityisen arvokas AMES -testauksissa johtuen sen erinomaisesta kyvystä aktivoida tietyt N - nitrosamiinit verrattuna rotan maksaan S9. Se jakaa läheisemmän aineenvaihduntaprofiilin ihmisen maksaentsyymeihin, mikä tekee siitä merkityksellisemmän ihmisen riskinarvioinnin kannalta. Lisäksi Hamster Maksa S9 sisältää korkeampia spesifisten sytokromi P450 -entsyymien tasoja, jotka ovat ratkaisevia mutageenien bioaktivoitumiselle. Tämä johtaa parantuneeseen herkkyyteen ja vähentyneisiin vääriin - negatiivisiin nopeuksiin, mikä mahdollistaa mutageenien paremman havaitsemisen, jotka voivat muuten olla havaittavissa pelkästään rotan maksan S9 kanssa.
Johtopäätös
Vaikka Standard Ames -testi on edelleen perustavanlaatuinen työkalu mutageenisuuden arvioimiseksi, sen rajoitukset vaativat parannuksia paremman tarkkuuden saavuttamiseksi. Parannettu AMES -testi, etenkin hamsterimaksan S9 -fraktion sisällyttämisessä, parantaa merkittävästi monimutkaisten mutageenien, kuten n - nitrosamiinien, havaitsemista, mikä kattaa bakteerien ja nisäkkäiden aineenvaihdunnan välillä. Tämä eteneminen tarjoaa luotettavamman menetelmän potentiaalisten karsinogeenien arvioimiseksi ja tukee parempaa sääntelypäätöstä - tekemistä.
Avainsanat: N - Nitrosamiinit, NDSRI, OECD 471, Enhanced Ames -testi, hamsterimaksa S9, sytokromi P450 -entsyymit, mutaatiotesti
Viestin aika: 2025 - 03 - 12 09:22:09