Amesin testi N-nitrosamiinille: Mutageenisuuden arviointi

Johdatus Ames-testiin

Amesin testi, joka tunnetaan myös nimellä bakteerien käänteismutaatiotesti, on laajalti käytetty biologisessa määrityksessä, joka arvioi kemiallisten yhdisteiden, mukaan lukien N-nitrosamiinit, mutageenisen potentiaalin. Tohtori Bruce Amesin 1970-luvulla kehittämä testi käyttää Salmonella typhimurium -bakteerin tiettyjä kantoja, jotka kantavat mutaatioita histidiinin synteesiin osallistuvissa geeneissä. Testi määrittää, voiko aine aiheuttaa mutaatioita bakteerien DNA:ssa, mikä antaa viitteitä mahdollisesta karsinogeenisuudesta ihmisille.

Amesin testin merkitys N-nitrosamiinien suhteen

N-Nitrosamiinit tunnetaan genotoksisista ja karsinogeenisista ominaisuuksistaan, koska ne voivat aiheuttaa DNA-vaurioita alkyloinnin ja oksidatiivisen stressin kautta. Amesin testi on erityisen hyödyllinen niiden mutageenisten vaikutusten havaitsemisessa, koska monet N-nitrosamiinit vaativat metabolista aktivaatiota entsymaattisen konversion kautta muodostaakseen erittäin reaktiivisia elektrofiilisiä välituotteita, jotka pystyvät olemaan vuorovaikutuksessa DNA:n kanssa. Tämä aktivaatio tapahtuu tyypillisesti maksassa sytokromi P450 -entsyymien kautta. Tämän metabolisen konversion toistamiseksi in vitro testi suoritetaan usein metabolisen aktivaation kanssa ja ilman sitä käyttämällä S9-sekoitusta, jyrsijöistä peräisin olevaa maksaentsyymivalmistetta, joka jäljittelee nisäkkäiden aineenvaihduntaa ja parantaa mutageenisen aktiivisuuden havaitsemista.

Amesin testin metodologia

Ames-testin vakiomenettely sisältää seuraavat vaiheet:

1. 1. Testikantojen valmistaminen: Käytetään Salmonella typhimurium -kantoja, joilla on jo olemassa olevia mutaatioita histidiinin synteesigeeneissä. Nämä kannat eivät voi kasvaa ilman ulkoista histidiinilähdettä, ellei käänteinen mutaatio palauta toimintaa.
2. 2. Altistus N-nitrosamiinille: Bakteeriviljelmä sekoitetaan testiyhdisteen (N-Nitrosamiini) kanssa minimaalisella agarmaljalla, joka sisältää pienen määrän histidiiniä.
3. 3. Metabolinen aktivaatio (S9-sekoituslisäys): Jotta voidaan ottaa huomioon metabolinen konversio ihmiskehossa, jotkin testinäytteet sisältävät S9-fraktiota, entsymaattista uutetta rotan maksan mikrosomeista.
4. 4. Inkubointi ja kasvatus: Levyjä inkuboidaan 37 °C:ssa 48 tuntia, jolloin bakteeripesäkkeet voivat kasvaa, jos tapahtuu mutaatioita, jotka palauttavat histidiinin synteesin.
5. 5. Pesäkkeiden laskenta ja analyysi: Revertanttien pesäkkeiden (bakteerit, jotka saivat takaisin kyvyn tuottaa histidiiniä) lukumäärä lasketaan ja verrataan kontrollilevyihin.
6. Tulosten tulkinta

• Positiivinen Amesin testi: Revertanttien pesäkkeiden merkittävä lisääntyminen kontrolliin verrattuna viittaa siihen, että yhdiste indusoi mutaatioita, mikä viittaa mutageenisiin ja mahdollisesti karsinogeenisiin ominaisuuksiin.
• Negatiivinen Amesin testi: Jos merkittävää lisäystä ei havaita, yhdiste on todennäköisesti ei-mutageeninen testiolosuhteissa.
• Annos-vastesuhde: Suuremmat annokset, jotka lisäävät mutaatioiden määrää, vahvistavat näyttöä mutageenisuudesta.

Johtopäätös

Amesin testi on nopea ja kustannustehokas menetelmä N-nitrosamiinien mutageenisuuden arvioimiseksi. Kun otetaan huomioon niiden yhteys syöpään, niiden mutageenisten ominaisuuksien tunnistaminen tämän testin avulla on ratkaisevan tärkeää sääntelyn valvonnan ja riskinarvioinnin kannalta. Tämä testi on edelleen kulmakivi toksikologisessa seulonnassa ja kemikaaliturvallisuusarvioinnissa.

Avainsanat: N-Nitrosamiinit, NDSRI:t, OECD 471, Enhanced Ames -testi, Hamsterin maksa S9, Sytokromi P450 -entsyymit, Mutaatiotesti