Proba estándar de Ames
A proba de Ames é un ensaio moi utilizado para detectar o potencial mutaxénico en compostos químicos, incluídas as nitrosaminas. A pesar da súa importancia no cribado toxicolóxico, a proba estándar de Ames ten varias limitacións, especialmente cando se avalía compostos que requiren unha activación metabólica complexa.
Limitacións da proba estándar de Ames
Aínda que a proba de Ames segue sendo unha pedra angular nas probas de mutagenicidade, ten certas limitacións:
- Activación metabólica limitada:
A proba estándar de Ames usa normalmente o fígado de rata S9, que carece de certos encimas relevantes do citocromo P450 (CYP). Isto pode levar á subactivación de procarcinóxenos (por exemplo, algunhas n - nitrosaminas) ou sobreactivación de riscos non humanos. Exemplo: a rata S9 metaboliza mal a n - nitrosodietilamina (NDEA) en comparación cos encimas humanos, arriscando falsos negativos.
- Detección de espectro de mutación limitada:
As cepas estándar (por exemplo, TA98, TA100) detectan só tipos de mutación específicos (Frameshifts, Base - Substitucións de pares), faltan clastoxenos ou canceríxenos epixenéticos.
- Máis - confianza en sistemas bacterianos:
Dado que a proba usa Salmonella Typhimurium, non ten en conta os mecanismos de reparación do ADN presentes nas células dos mamíferos, faltando potencialmente algúns efectos mutaxénicos.
- Falsos positivos e negativos:
Algúns compostos non mutaxénicos poden producir resultados positivos debido ás respostas do estrés bacteriano, mentres que algúns mutáxenos que requiren unha activación metabólica complexa poden non ser detectados.
A proba de Ames mellorada
O último lanzamento da EMA, a orientación de Q&S afirma que debido á baixa sensibilidade dalgunhas nitrosaminas (por exemplo, NDMA) nas condicións da proba de Ames estándar, recoméndanse as condicións da proba de Ames mellorada polo Centro Nacional de Investigación Toxicolóxica da FDA (NCTR). A FDA concluíu que os métodos estándar empregados para a proba AMES poden non ser suficientes para caracterizar o potencial mutaxénico de N - nitrosaminas e, nalgúns casos, pode producir resultados negativos para nitrosaminas mutaxénicas coñecidas. En resposta, o Centro Nacional de Investigación Toxicolóxica da FDA foi probando diferentes condicións para desenvolver a proba de Ames mellorada, que pretende proporcionar unha avaliación máis fiable do potencial mutaxénico das impurezas de nitrosamina.
A FDA proporciona as seguintes condicións de proba de Ames (EAT).
|
Cepas de proba |
Inclúe Salmonella Typhimurium TA98, TA100. TA1535, TA1537 e Escherichia coli WP2 UVRA (PKM101) Proba Cepas de proba |
|
Método de proba e tempo de illamento pre - |
Deberían empregarse métodos de illamento e de illamento e non - |
|
Tipo e concentración S9 |
A proba de Ames mellorada debe realizarse en conter un 30% de fígado de rata S9 e 30%Hamster Fígado S9. Os sobrenadantes desmosómicos de rata e hámster deben prepararse a partir de fígados de roedores tratados conencima citocromo P450- Substancias inducidas (por exemplo, unha combinación de fenobarbital e β - naftoflavona). |
|
Control negativo (disolvente/excipiente) |
Os disolventes empregados deberían ser compatibles coa proba de Ames segundoOCDE 471Directrices. Os disolventes dispoñibles inclúen, pero non se limitan a: (1) auga; (2) disolventes orgánicos como acetonitrilo, metanol e sulfóxido de dimetilo (DMSO). Cando se utilizan disolventes orgánicos, debe usarse o menor volume posible na mestura pre - de mantemento e débese demostrar que a cantidade de disolvente orgánico empregado non interfire coa activación metabólica de n - nitrosaminas. |
|
Control positivo |
Segundo as directrices da OCDE 471, a cepa - Os controis positivos específicos deben realizarse ao mesmo tempo. En presenza de S9, as dúas n - nitrosaminas coñecidas por ser mutaxénicas tamén deben usarse como controis positivos. Os controis positivos de nitrosamina dispoñibles inclúen: NDMA, 1 - Ciclopentil - 4 - Nitrosopiperazine Ndsris。 |
|
Todas as outras recomendacións sobre a determinación de AMES deben seguir as directrices da OCDE 471 |
|
Vantaxe única do hámster fígado S9 fracción
A fracción de hámster do fígado S9 é particularmente valiosa nas probas de AMES debido á súa capacidade superior para activar certas N - nitrosaminas en comparación co fígado de rata S9. Comparte un perfil metabólico máis estreito para as enzimas hepáticas humanas, tornándoo máis relevante para a avaliación do risco humano. Ademais, o fígado de hámster S9 contén maiores niveis de encimas específicas de citocromo P450, que son cruciais para a bioactivación de mutáxenos. Isto resulta nunha sensibilidade mellorada e reducidas taxas falsas - negativas, permitindo unha mellor detección de mutáxenos que doutro xeito poden non ser detectados só con fígado de rata S9.
Conclusión
Aínda que a proba estándar de Ames segue sendo unha ferramenta fundamental para avaliar a mutaxenicidade, as súas limitacións precisan melloras para unha mellor precisión. A proba de Ames mellorada, particularmente coa inclusión da fracción de hígado de hámster S9, aumenta significativamente a detección de mutáxenos complexos como as nitrosaminas, cubrindo a brecha entre o metabolismo bacteriano e os mamíferos. Este avance proporciona un método máis fiable para avaliar os potenciais canceríxenos humanos e apoia unha mellor decisión reguladora - Tomar.
Palabras clave: n - nitrosaminas, NDSRIS, OCDE 471, proba de Ames mellorada, hámster fígado S9, citocromo P450 encimas, proba de mutación
Tempo de publicación: 2025 - 03 - 12 09:22:09