Test de Ames para N-Nitrosaminas: Avaliación da mutaxenicidade

Introdución á proba de Ames

A proba de Ames, tamén coñecida como proba de mutación inversa bacteriana, é unha proba biolóxica moi utilizada que avalía o potencial mutaxénico de compostos químicos, incluídas as N-nitrosaminas. Desenvolvida polo doutor Bruce Ames na década de 1970, esta proba utiliza cepas específicas da bacteria Salmonella typhimurium que portan mutacións en xenes implicados na síntese de histidina. A proba determina se unha substancia pode causar mutacións no ADN bacteriano, proporcionando unha indicación da potencial carcinoxenicidade en humanos.

Relevancia do Test de Ames para N-Nitrosaminas

As N-nitrosaminas son coñecidas polas súas propiedades xenotóxicas e canceríxenas, xa que poden inducir danos no ADN mediante a alquilación e o estrés oxidativo. A proba de Ames é particularmente útil para detectar os seus efectos mutaxénicos, xa que moitas N-nitrosaminas requiren activación metabólica mediante conversión enzimática para formar intermediarios electrofílicos altamente reactivos capaces de interactuar co ADN. Esta activación ocorre normalmente no fígado a través dos encimas do citocromo P450. Para replicar esta conversión metabólica in vitro, a proba adoita realizarse con e sen activación metabólica mediante a mestura S9, unha preparación de encimas hepáticas derivada de roedores, que imita o metabolismo dos mamíferos e mellora a detección da actividade mutaxénica.

Metodoloxía da proba de Ames

O procedemento normalizado da proba de Ames consta dos seguintes pasos:

1. 1. Preparación de cepas de proba: utilízanse cepas de Salmonella typhimurium con mutacións preexistentes nos xenes de síntese de histidina. Estas cepas non poden crecer sen unha fonte externa de histidina a menos que unha mutación inversa restaure a función.
2. 2. Exposición a N-Nitrosaminas: o cultivo bacteriano mestúrase co composto de proba (N-Nitrosamina) nunha placa de agar mínima que contén unha pequena cantidade de histidina.
3. 3. Activación metabólica (S9 Mix Addition): para ter en conta a conversión metabólica no corpo humano, algunhas mostras de proba inclúen a fracción S9, un extracto enzimático de microsomas de fígado de rata.
4. 4. Incubación e crecemento: as placas incúbanse a 37°C durante 48 horas, permitindo que as colonias bacterianas medren se se producen mutacións que restablecen a síntese de histidina.
5. 5. Reconto e análise de colonias: cóntase e compárase o número de colonias revertantes (bacterias que recuperaron a capacidade de producir histidina) coas placas control.
6. Interpretación de resultados

• Proba de Ames positiva: un aumento significativo das colonias revertantes en comparación co control suxire que o composto induce mutacións, o que implica propiedades mutaxénicas e potencialmente canceríxenas.
• Proba de Ames negativa: se non se observa un aumento significativo, é probable que o composto non sexa mutaxénico nas condicións da proba.
• Relación Dose-Resposta: As doses máis altas que provocan un aumento das taxas de mutación reforzan a evidencia de mutaxenicidade.

Conclusión

A proba de Ames é un método rápido e rendible para avaliar a mutaxenicidade das N-nitrosaminas. Dada a súa asociación co cancro, identificar as súas propiedades mutaxénicas a través deste ensaio é fundamental para o control regulamentario e a avaliación do risco. Esta proba segue sendo unha pedra angular no cribado toxicolóxico e na avaliación da seguridade química.

Palabras chave: N-Nitrosaminas, NDSRI, OCDE 471, Enhanced Ames test, Hamster hever S9, Cytochrome P450 encimas, Mutation Test