Amesov test za N-nitrozamine: Procjena mutagenosti

Uvod u Amesov test

Amesov test, također poznat kao Bakterijski test reverzne mutacije, široko se koristi za biološki test koji procjenjuje mutageni potencijal hemijskih jedinjenja, uključujući N-Nitrozamine. Razvio ga je dr. Bruce Ames 1970-ih, ovaj test koristi specifične sojeve bakterije Salmonella typhimurium koji nose mutacije u genima uključenim u sintezu histidina. Test utvrđuje može li supstanca uzrokovati mutacije u bakterijskoj DNK, što ukazuje na potencijalnu kancerogenost kod ljudi.

Relevantnost Amesovog testa za N-nitrozamine

N-Nitrozamini su poznati po svojim genotoksičnim i kancerogenim svojstvima, jer mogu izazvati oštećenje DNK alkilacijom i oksidativnim stresom. Amesov test je posebno koristan u otkrivanju njihovih mutagenih efekata, jer mnogi N-Nitrozamini zahtijevaju metaboličku aktivaciju putem enzimske konverzije kako bi se formirali visoko reaktivni elektrofilni intermedijeri sposobni za interakciju sa DNK. Ova aktivacija se obično događa u jetri putem enzima citokroma P450. Da bi se ponovila ova metabolička konverzija in vitro, test se često provodi sa i bez metaboličke aktivacije koristeći S9 mix, preparat jetrenih enzima dobiven od glodara, koji oponaša metabolizam sisara i poboljšava otkrivanje mutagene aktivnosti.

Metodologija Amesovog testa

Standardna procedura Amesovog testa uključuje sljedeće korake:

1. 1. Priprema testnih sojeva: Koriste se sojevi Salmonella typhimurium sa već postojećim mutacijama u genima za sintezu histidina. Ovi sojevi ne mogu rasti bez vanjskog izvora histidina osim ako reverzna mutacija ne obnovi funkciju.
2. 2. Izloženost N-Nitrozaminima: Bakterijska kultura se pomeša sa test jedinjenjem (N-Nitrozamin) na minimalnoj agar ploči koja sadrži malu količinu histidina.
3. 3. Metabolička aktivacija (S9 Mix Addition): Da bi se uzela u obzir metabolička konverzija u ljudskom tijelu, neki testni uzorci uključuju S9 frakciju, enzimski ekstrakt iz mikrosoma jetre pacova.
4. 4. Inkubacija i rast: Ploče se inkubiraju na 37°C 48 sati, omogućavajući bakterijskim kolonijama da rastu ako se pojave mutacije koje obnavljaju sintezu histidina.
5. 5. Brojanje i analiza kolonija: Broj revertiranih kolonija (bakterije koje su povratile sposobnost da proizvode histidin) se broji i upoređuje sa kontrolnim pločama.
6. Interpretacija rezultata

• Pozitivan Amesov test: Značajno povećanje revertantnih kolonija u poređenju sa kontrolom ukazuje na to da jedinjenje izaziva mutacije, što implicira mutagena i potencijalno kancerogena svojstva.
• Negativan Amesov test: Ako se ne primećuje značajno povećanje, jedinjenje verovatno nije-mutageno pod uslovima testa.
• Odnos doza-odgovor: veće doze koje dovode do povećane stope mutacije jačaju dokaze o mutagenosti.

Zaključak

Amesov test je brza i isplativa metoda za procjenu mutagenosti N-Nitrozamina. S obzirom na njihovu povezanost s rakom, identifikacija njihovih mutagenih svojstava kroz ovaj test je ključna za regulatornu kontrolu i procjenu rizika. Ovaj test ostaje kamen temeljac u toksikološkom skriningu i ocjeni kemijske sigurnosti.

Ključne riječi: N-Nitrozamini, NDSRI, OECD 471, poboljšani Amesov test, jetra hrčka S9, enzimi citokroma P450, test mutacije