Test d'Ames pour les N-Nitrosamines : évaluation de la mutagénicité

Introduction au test d'Ames

Le test d'Ames, également connu sous le nom de test de mutation bactérienne inverse, est un test biologique largement utilisé qui évalue le potentiel mutagène de composés chimiques, notamment les N-nitrosamines. Développé par le Dr Bruce Ames dans les années 1970, ce test utilise des souches spécifiques de la bactérie Salmonella typhimurium qui portent des mutations dans les gènes impliqués dans la synthèse de l'histidine. Le test détermine si une substance peut provoquer des mutations dans l'ADN bactérien, fournissant ainsi une indication de cancérogénicité potentielle chez l'homme.

Pertinence du test d'Ames pour les N-Nitrosamines

Les N-nitrosamines sont connues pour leurs propriétés génotoxiques et cancérigènes, car elles peuvent induire des dommages à l'ADN par alkylation et stress oxydatif. Le test d'Ames est particulièrement utile pour détecter leurs effets mutagènes, car de nombreuses N-nitrosamines nécessitent une activation métabolique via une conversion enzymatique pour former des intermédiaires électrophiles hautement réactifs capables d'interagir avec l'ADN. Cette activation se produit généralement dans le foie par l’intermédiaire des enzymes du cytochrome P450. Pour reproduire cette conversion métabolique in vitro, le test est souvent réalisé avec et sans activation métabolique en utilisant le mélange S9, une préparation d'enzymes hépatiques dérivée de rongeurs, qui imite le métabolisme des mammifères et améliore la détection de l'activité mutagène.

Méthodologie du test d'Ames

La procédure standard du test Ames comprend les étapes suivantes :

1. 1. Préparation des souches de test : Des souches de Salmonella typhimurium présentant des mutations préexistantes dans les gènes de synthèse de l'histidine sont utilisées. Ces souches ne peuvent pas se développer sans une source externe d’histidine, à moins qu’une mutation inverse ne rétablisse leur fonction.
2. 2. Exposition aux N-Nitrosamines : La culture bactérienne est mélangée au composé testé (N-Nitrosamine) sur une plaque de gélose minimale contenant une petite quantité d'histidine.
3. 3. Activation métabolique (ajout du mélange S9) : Pour tenir compte de la conversion métabolique dans le corps humain, certains échantillons de test incluent la fraction S9, un extrait enzymatique de microsomes hépatiques de rat.
4. 4. Incubation et croissance : Les plaques sont incubées à 37°C pendant 48 heures, permettant aux colonies bactériennes de se développer si des mutations se produisent et rétablissent la synthèse de l'histidine.
5. 5. Comptage et analyse des colonies : Le nombre de colonies révertantes (bactéries qui ont retrouvé la capacité de produire de l'histidine) est compté et comparé aux plaques témoins.
6. Interprétation des résultats

• Test d'Ames positif : une augmentation significative des colonies révertantes par rapport au contrôle suggère que le composé induit des mutations, impliquant des propriétés mutagènes et potentiellement cancérigènes.
• Test d'Ames négatif : Si aucune augmentation significative n'est observée, le composé est probablement non mutagène dans les conditions du test.
• Relation dose-réponse : des doses plus élevées entraînant une augmentation des taux de mutation renforcent les preuves de mutagénicité.

Conclusion

Le test d'Ames est une méthode rapide et rentable pour évaluer la mutagénicité des N-Nitrosamines. Compte tenu de leur association avec le cancer, l’identification de leurs propriétés mutagènes grâce à ce test est cruciale pour le contrôle réglementaire et l’évaluation des risques. Ce test reste la pierre angulaire du dépistage toxicologique et de l’évaluation de la sécurité chimique.

Mots clés : N-Nitrosamines, NDSRI, OCDE 471, test d'Ames amélioré, foie de hamster S9, enzymes du cytochrome P450, test de mutation