Amesi test N-nitrosamiinide jaoks: mutageensuse hindamine

Sissejuhatus Amesi testi

Amesi test, tuntud ka kui bakterite pöördmutatsiooni test, on laialdaselt kasutatav bioloogiliseks testiks, mis hindab keemiliste ühendite, sealhulgas N-nitrosamiinide mutageenset potentsiaali. See test, mille töötas välja dr Bruce Ames 1970. aastatel, kasutab spetsiifilisi Salmonella typhimurium bakteri tüvesid, mis kannavad mutatsioone histidiini sünteesis osalevates geenides. Katse määrab, kas aine võib põhjustada mutatsioone bakteriaalses DNA-s, mis annab märku võimalikust kantserogeensusest inimestel.

Amesi testi asjakohasus N-nitrosamiinide jaoks

N-Nitrosamiinid on tuntud oma genotoksiliste ja kantserogeensete omaduste poolest, kuna need võivad alküülimise ja oksüdatiivse stressi kaudu esile kutsuda DNA kahjustusi. Amesi test on eriti kasulik nende mutageensete mõjude tuvastamiseks, kuna paljud N-nitrosamiinid vajavad metaboolset aktiveerimist ensümaatilise muundamise kaudu, et moodustada väga reaktiivseid elektrofiilseid vaheühendeid, mis on võimelised DNA-ga interakteeruma. See aktiveerimine toimub tavaliselt maksas tsütokroom P450 ensüümide kaudu. Selle metaboolse konversiooni kordamiseks in vitro tehakse test sageli metaboolse aktiveerimisega ja ilma, kasutades S9 segu, närilistelt saadud maksaensüümipreparaati, mis jäljendab imetajate metabolismi ja suurendab mutageense aktiivsuse tuvastamist.

Amesi testi metoodika

Amesi testi standardprotseduur hõlmab järgmisi samme:

1. 1. Testitavate tüvede valmistamine: kasutatakse Salmonella typhimurium'i tüvesid, millel on histidiini sünteesi geenides juba olemas mutatsioonid. Need tüved ei saa kasvada ilma välise histidiiniallikata, välja arvatud juhul, kui pöördmutatsioon taastab funktsiooni.
2. 2. Kokkupuude N-nitrosamiinidega: Bakterikultuur segatakse testitava ühendiga (N-nitrosamiin) minimaalsel agarplaadil, mis sisaldab väikest kogust histidiini.
3. 3. Metaboolne aktiveerimine (S9 segu lisamine): inimkehas toimuva metaboolse konversiooni arvessevõtmiseks sisaldavad mõned testitavad proovid S9 fraktsiooni, roti maksa mikrosoomide ensümaatilist ekstrakti.
4. 4. Inkubeerimine ja kasvatamine: plaate inkubeeritakse 37°C juures 48 tundi, võimaldades bakterikolooniatel kasvada, kui esinevad mutatsioonid, mis taastavad histidiini sünteesi.
5. 5. Kolooniate loendamine ja analüüs: Revertantsete kolooniate (bakterid, mis said uuesti võime toota histidiini) arv loendatakse ja võrreldakse kontrollplaatidega.
6. Tulemuste tõlgendamine

• Positiivne Amesi test: revertantsete kolooniate märkimisväärne suurenemine võrreldes kontrolliga viitab sellele, et ühend kutsub esile mutatsioone, mis viitab mutageensetele ja potentsiaalselt kantserogeensetele omadustele.
• Negatiivne Amesi test: kui olulist suurenemist ei täheldata, on ühend tõenäoliselt katsetingimustes mittemutageenne.
• Annuse-vastuse suhe: Suuremad annused, mis põhjustavad mutatsioonimäärade suurenemist, tugevdavad mutageensuse tõendeid.

Järeldus

Amesi test on kiire ja kulutõhus meetod N-nitrosamiinide mutageensuse hindamiseks. Arvestades nende seost vähiga, on nende mutageensete omaduste kindlakstegemine selle testiga regulatiivse kontrolli ja riskihindamise jaoks ülioluline. See test jääb toksikoloogilise sõeluuringu ja kemikaaliohutuse hindamise nurgakiviks.

Märksõnad: N-Nitrosamiinid, NDSRI-d, OECD 471, Enhanced Amesi test, hamstri maks S9, tsütokroom P450 ensüümid, mutatsioonitest