Amesov test za N-nitrozamine: Procjena mutagenosti

Uvod u Amesov test

Amesov test, poznat i kao test bakterijske reverzne mutacije, široko je korišten za biološke testove koji procjenjuju mutageni potencijal kemijskih spojeva, uključujući N-nitrozamine. Razvio ga je dr. Bruce Ames 1970-ih, ovaj test koristi specifične sojeve bakterije Salmonella typhimurium koji nose mutacije u genima uključenim u sintezu histidina. Testom se utvrđuje može li tvar uzrokovati mutacije u bakterijskoj DNK, što ukazuje na potencijalnu karcinogenost kod ljudi.

Relevantnost Amesovog testa za N-nitrozamine

N-Nitrozamini su poznati po svojim genotoksičnim i kancerogenim svojstvima, jer mogu izazvati oštećenje DNK alkilacijom i oksidativnim stresom. Amesov test posebno je koristan u otkrivanju njihovih mutagenih učinaka, jer mnogi N-nitrozamini zahtijevaju metaboličku aktivaciju putem enzimske pretvorbe kako bi se formirali visoko reaktivni elektrofilni intermedijeri sposobni za interakciju s DNA. Ta se aktivacija obično događa u jetri putem enzima citokroma P450. Kako bi se ponovila ova metabolička pretvorba in vitro, test se često provodi sa i bez metaboličke aktivacije koristeći S9 mix, pripravak enzima jetre dobiven iz glodavaca, koji oponaša metabolizam sisavaca i poboljšava otkrivanje mutagene aktivnosti.

Metodologija Amesovog testa

Standardni postupak Amesovog testa uključuje sljedeće korake:

1. 1. Priprema testnih sojeva: Koriste se sojevi Salmonella typhimurium s već postojećim mutacijama u genima za sintezu histidina. Ovi sojevi ne mogu rasti bez vanjskog izvora histidina osim ako reverzna mutacija ne obnovi funkciju.
2. 2. Izlaganje N-Nitrozaminima: Bakterijska kultura se pomiješa s ispitivanim spojem (N-Nitrozamin) na minimalnoj agar ploči koja sadrži malu količinu histidina.
3. 3. Metabolička aktivacija (dodavanje mješavine S9): Kako bi se objasnila metabolička pretvorba u ljudskom tijelu, neki ispitni uzorci uključuju S9 frakciju, enzimski ekstrakt iz mikrosoma jetre štakora.
4. 4. Inkubacija i rast: Ploče se inkubiraju na 37°C 48 sati, omogućujući bakterijskim kolonijama da rastu ako dođe do mutacija koje obnavljaju sintezu histidina.
5. 5. Brojanje i analiza kolonija: Broj povratnih kolonija (bakterija koje su povratile sposobnost proizvodnje histidina) se broji i uspoređuje s kontrolnim pločama.
6. Tumačenje rezultata

• Pozitivan Amesov test: Značajno povećanje revertantnih kolonija u usporedbi s kontrolom sugerira da spoj izaziva mutacije, što ukazuje na mutagena i potencijalno kancerogena svojstva.
• Negativan Amesov test: Ako se ne primijeti značajno povećanje, spoj vjerojatno nije mutagen pod uvjetima ispitivanja.
• Odnos doza/odgovor: Veće doze koje dovode do povećanih stopa mutacija pojačavaju dokaz mutagenosti.

Zaključak

Amesov test brza je i isplativa metoda za procjenu mutagenosti N-nitrozamina. S obzirom na njihovu povezanost s rakom, utvrđivanje njihovih mutagenih svojstava ovim testom ključno je za regulatornu kontrolu i procjenu rizika. Ovaj test ostaje kamen temeljac u toksikološkom pregledu i procjeni kemijske sigurnosti.

Ključne riječi: N-nitrozamini, NDSRI, OECD 471, poboljšani Amesov test, jetra hrčka S9, enzimi citokroma P450, mutacijski test