Amesov test za N-nitrozamine: ocenjevanje mutagenosti

Uvod v Amesov test

Amesov test, znan tudi kot test bakterijske povratne mutacije, se pogosto uporablja za biološki test, ki ocenjuje mutageni potencial kemičnih spojin, vključno z N-nitrozamini. Ta test, ki ga je v sedemdesetih letih prejšnjega stoletja razvil dr. Bruce Ames, uporablja specifične seve bakterije Salmonella typhimurium, ki prenašajo mutacije v genih, ki sodelujejo pri sintezi histidina. Test ugotavlja, ali lahko snov povzroči mutacije v bakterijski DNK, kar kaže na potencialno rakotvornost pri ljudeh.

Ustreznost Amesovega testa za N-nitrozamine

N-Nitrozamini so znani po svojih genotoksičnih in rakotvornih lastnostih, saj lahko povzročijo poškodbe DNA z alkilacijo in oksidativnim stresom. Amesov test je še posebej uporaben pri odkrivanju njihovih mutagenih učinkov, saj mnogi N-nitrozamini zahtevajo presnovno aktivacijo prek encimske pretvorbe, da se tvorijo visoko reaktivni elektrofilni intermediati, ki so sposobni interakcije z DNA. Ta aktivacija se običajno pojavi v jetrih prek encimov citokroma P450. Za ponovitev te presnovne pretvorbe in vitro se test pogosto izvaja z in brez presnovne aktivacije z uporabo mešanice S9, pripravka jetrnih encimov, pridobljenega iz glodalcev, ki posnema presnovo sesalcev in izboljša odkrivanje mutagene aktivnosti.

Metodologija Amesovega testa

Standardni postopek Amesovega testa vključuje naslednje korake:

1. 1. Priprava testnih sevov: Uporabljeni so sevi Salmonella typhimurium z že obstoječimi mutacijami v genih za sintezo histidina. Ti sevi ne morejo rasti brez zunanjega vira histidina, razen če povratna mutacija obnovi funkcijo.
2. 2. Izpostavljenost N-Nitrozaminom: Bakterijska kultura se zmeša s preskusno spojino (N-Nitrozamin) na plošči z minimalnim agarjem, ki vsebuje majhno količino histidina.
3. 3. Presnovna aktivacija (dodatek mešanice S9): Da bi upoštevali presnovno pretvorbo v človeškem telesu, nekateri testni vzorci vključujejo frakcijo S9, encimski izvleček iz mikrosomov jeter podgan.
4. 4. Inkubacija in rast: Plošče se inkubirajo pri 37 °C 48 ur, kar omogoča rast bakterijskih kolonij, če pride do mutacij, ki obnovijo sintezo histidina.
5. 5. Štetje kolonij in analiza: Število revertantnih kolonij (bakterij, ki so ponovno pridobile sposobnost proizvajanja histidina) se prešteje in primerja s kontrolnimi ploščami.
6. Interpretacija rezultatov

• Pozitiven Amesov test: znatno povečanje revertantnih kolonij v primerjavi s kontrolo nakazuje, da spojina povzroča mutacije, kar kaže na mutagene in potencialno rakotvorne lastnosti.
• Negativen Amesov test: Če ni opaziti znatnega povečanja, spojina v preskusnih pogojih verjetno ni mutagena.
• Razmerje med odmerkom in odzivom: višji odmerki, ki vodijo do povečanih stopenj mutacij, okrepijo dokaze o mutagenosti.

Zaključek

Amesov test je hitra in stroškovno učinkovita metoda za ocenjevanje mutagenosti N-nitrozaminov. Glede na njihovo povezavo z rakom je prepoznavanje njihovih mutagenih lastnosti s tem testom ključnega pomena za regulativni nadzor in oceno tveganja. Ta test ostaja temelj pri toksikološkem presejanju in oceni kemijske varnosti.

Ključne besede: N-nitrozamini, NDSRI, OECD 471, izboljšan Amesov test, jetra hrčka S9, encimi citokroma P450, mutacijski test