Δοκιμή Ames για Ν - Νιτροζαμίνες: Αξιολόγηση της μεταλλαξιογένεσης

Εισαγωγή στη δοκιμή Ames

Η δοκιμή AMES, γνωστή και ως δοκιμή αντίστροφης μετάλλαξης βακτηρίων, είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη για βιολογική δοκιμασία που αξιολογεί το μεταλλαξιογόνο δυναμικό των χημικών ενώσεων, συμπεριλαμβανομένων των νιτροζαμινών. Αναπτύχθηκε από τον Dr. Bruce Ames στη δεκαετία του 1970, αυτή η δοκιμή χρησιμοποιεί συγκεκριμένα στελέχη του βακτηρίου Salmonella typhimurium που μεταφέρουν μεταλλάξεις σε γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεση ιστιδίνης. Η δοκιμή καθορίζει εάν μια ουσία μπορεί να προκαλέσει μεταλλάξεις στο βακτηριακό DNA, παρέχοντας ένδειξη πιθανής καρκινογένεσης στους ανθρώπους.

Συνάφεια της δοκιμής AMES για N - νιτροαμίνες

Οι νιτροζαμίνες είναι γνωστές για τις γονιδιοτοξικές και καρκινογόνες ιδιότητές τους, καθώς μπορούν να προκαλέσουν βλάβη του DNA μέσω αλκυλίωσης και οξειδωτικού στρες. Η δοκιμή AMES είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την ανίχνευση των μεταλλαξιογόνων αποτελεσμάτων τους, καθώς πολλές νιτροζαμίνες απαιτούν μεταβολική ενεργοποίηση μέσω ενζυματικής μετατροπής για να σχηματίσουν εξαιρετικά αντιδραστικά ηλεκτρόφιλα ενδιάμεσα ικανά να αλληλεπιδρούν με το DNA. Αυτή η ενεργοποίηση συνήθως εμφανίζεται στο ήπαρ μέσω ενζύμων κυτοχρώματος Ρ450. Για να αναπαραχθεί αυτή η μεταβολική μετατροπή in vitro, η δοκιμή συχνά διεξάγεται με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση χρησιμοποιώντας το S9 Mix, ένα παρασκεύασμα ενζύμου του ήπατος που προέρχεται από τρωκτικά, τα οποία μιμούνται τον μεταβολισμό των θηλαστικών και ενισχύουν την ανίχνευση μεταλλαξιογόνου δραστικότητας.

Μεθοδολογία του τεστ Ames

Η τυποποιημένη διαδικασία της δοκιμής AMES περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:

1. 1. Παρασκευή στελεχών δοκιμών: Χρησιμοποιούνται στελέχη Salmonella typhimurium με προ -υπάρχουσες μεταλλάξεις σε γονίδια σύνθεσης ιστιδίνης. Αυτά τα στελέχη δεν μπορούν να αναπτυχθούν χωρίς μια εξωτερική πηγή ιστιδίνης, εκτός εάν μια αντίστροφη μετάλλαξη αποκαθιστά τη λειτουργία.
2. 2. Έκθεση σε Ν - Νιτροζαμίνες: Η βακτηριακή καλλιέργεια αναμιγνύεται με τη δοκιμαστική ένωση (Ν - νιτροζαμίνη) σε μια ελάχιστη πλάκα άγαρ που περιέχει μια μικρή ποσότητα ιστιδίνης.
3. 3. Μεταβολική ενεργοποίηση (προσθήκη μίγματος S9): Για να ληφθεί υπόψη η μεταβολική μετατροπή στο ανθρώπινο σώμα, ορισμένα δείγματα δοκιμής περιλαμβάνουν το κλάσμα S9, ένα ενζυματικό εκχύλισμα από μικροσώματα του ήπατος αρουραίου.
4. 4. ΕΠΟΜΕΝΗ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ: Οι πλάκες επωάζονται στους 37 ° C για 48 ώρες, επιτρέποντας την ανάπτυξη βακτηριακών αποικιών εάν εμφανιστούν μεταλλάξεις που αποκαθιστούν τη σύνθεση ιστιδίνης.
5. 5. Καταμέτρηση και Ανάλυση Αποικιών: Ο αριθμός των αποικιών που επαναλαμβάνουν (βακτηρίδια που επανέκτησαν την ικανότητα παραγωγής ιστιδίνης) μετράνε και συγκρίνεται με τις πλάκες ελέγχου.
6. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων

• Θετική δοκιμή AMES: Μια σημαντική αύξηση στις επαναστατικές αποικίες σε σύγκριση με τον έλεγχο υποδηλώνει ότι η ένωση προκαλεί μεταλλάξεις, που υποδηλώνουν μεταλλαξιογόνες και δυνητικά καρκινογόνες ιδιότητες.
• Αρνητική δοκιμή AMES: Εάν δεν παρατηρηθεί σημαντική αύξηση, η ένωση είναι πιθανώς μη - μεταλλαξιογόνο υπό τις συνθήκες δοκιμής.
• Δόση - Σχέση απόκρισης: Οι υψηλότερες δόσεις που οδηγούν σε αυξημένους ρυθμούς μετάλλαξης ενισχύουν τα στοιχεία της μεταλλαξιογένεσης.

Σύναψη

Η δοκιμή AMES είναι μια ταχεία και κόστος - αποτελεσματική μέθοδος για την αξιολόγηση της μεταλλαξιογένεσης των νιτροζαμινών. Δεδομένης της σύνδεσής τους με τον καρκίνο, ο προσδιορισμός των μεταλλαξιογόνων ιδιοτήτων τους μέσω αυτής της ανάλυσης είναι ζωτικής σημασίας για τον ρυθμιστικό έλεγχο και την αξιολόγηση του κινδύνου. Αυτή η δοκιμή παραμένει ένας ακρογωνιαίος λίθος στην τοξικολογική εξέταση και την αξιολόγηση της χημικής ασφάλειας.

Λέξεις -κλειδιά: N - νιτροαμίνες, NDSRIS, OECD 471, Ενισχυμένη δοκιμή AMES, ήπατος χάμστερ S9, ένζυμα κυτοχρώματος Ρ450, δοκιμή μετάλλαξης